Langendorf
Cuadernos para investigar
Corazón
Metodología para el estudio del corazón mediante el sistema Langendorf
El sistema Langendorff nos permite trabajar con un corazón aislado y perfundido, sin la influencia del sistema neurológico y de hormonas, para analizar parámetros eléctricos y mecánicos .
La actividad del miocardio se mantiene gracias a la perfusión de una solución oxigenada y mantenida a 37ºC a través de la raíz aórtica a todo el territorio coronario, de modo que queda asegurada la nutrición y oxigenación de todo el corazón.
1.-Solución nutricia utilizada:
La solución salina empleada para la extracción y posterior perfusión del corazón, una vez colocado en el circuito del sistema de Langendorff fue la solución de Krebs-Henseleit
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Tabla 1: Solución Krebs-Henseleit modificada |
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Compuesto PM mmol/L g/L |
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NaCl KCl MgSO4 K2PO4 CaCl2 NaHCO3 Glucosa |
58.44 74.56 246.48 136.09 110.99 84.01 181.6 |
118.5 4.7 1.2 1.2 2.5 24.8 5 |
7 .223 .114 .163 .280 2.350 .900 |
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Composición de la solución de Krebs-Henseleit modificada utilizada en nuestro laboratorio, expresada en mmol/L y en g/L. Se refleja también los pesos moleculares de todos los componentes |
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2.-Modelo experimental y extracción del corazón
El modelo experimental es el conejo de la raza “White New Zeland”, con certificado de haber sido criados y mantenidos según las normas y regulaciones del Laboratory Animal Breeders Association Accreditation Scheme (L.A.B.A.A.S.) para uso de animales de experimentación.
Todos los animales han de ser tratados según las normas establecidas en la Convención Europea para la protección de animales empleados con fines experimentales recogidas en el Real Decreto 223/1988 BOE 18 y la Orden del 13 de Octubre de 1989.
3.-Composicion general del sistema Langendorff (Figura 1)
Detalles
- Mesa de acero inoxidable, que constituye el soporte de todo el aparato.
- Depósito o Reservorio para la solución salina de perfusión Krebs. Tiene una capacidad de 3 litros y permite que el líquido sea burbujeado con carbógeno durante todo el experimento (Figura 2).
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- Bomba peristáltica de perfusión con control de flujo que nos permita seleccionar la velocidad de flujo que necesitemos y mantenerla fija durante toda la experiencia. (Figura 3)
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- Atrapador de burbujasNos permite evitar las pocas burbujas que aparezcan durante la perfusión del corazón, evitando que estas pasen a la circulación coronaria.(Figura 4)
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- Jeringa de precisión con micrómetro, con balón intraventricular que llenamos con un volumen conocido hasta obtener la presión diastólica que queremos fijar. La jeringa la llenamos con agua destilada o con etanol. (Figura 5)
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- Calentador de agua con termostato, bomba de agua y sistema de intercambio de calor (Figura 6), para calentar la solución de perfusión.Esta agua circula a través de un intercambiador de calor de manera que calienta la solución salina de perfusión a 36ºC
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- Rotámetro o regulador de presión para el ajuste de flujo de carbógeno para el burbujeo de la solución de perfusión en el reservorio.(Figura 7)
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- Cánula aórtica de acero inoxidable y extremo de cerámica que permite la conexión del corazón a través de la aorta ascendente al sistema de perfusión (Figura 8). El corazón es atado a la cánula mediante un hilo de seda trenzada del nº 5.
- Sistema Power Lab para la adquisición de datos analógicos a digital: de ADInstrument formado por tres amplificadores unidos a uno general del que se van a mandar los datos al ordenador. (figura 9)
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- Soporte informático: ordenador con programa informático Chart 5.0 para Windows de ADInstruments para la monitorización de las variables recogidas del corazón y para la obtención de otras variables calculadas a partir de las recogidas de forma directa. (véase figura 10)
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La conexión entre algunos de los elementos que conforman el sistema se realiza mediante tubuladuras y conectores que constituyen el material fungible, y que fueron reemplazados con regularidad:
- Llaves de tres pasos con y sin alargaderas
- Tubos de Tygon de 1/4 * 1/6.
- Jeringas desechables de 5, 10 y 20 mL
- Agujas de 23 G.
- Balón intraventricular de látex nº 12 (Figura 8), conectado mediante una cánula de acero y alargadera a la jeringa de precisión con micrómetro y a un transductor de presión. Este conjunto constituye el sistema para el registro de presión isovolumétrica desarrollado por el corazón aislado.
- Un segundo transductor de presión conectado a la cánula aórtica a través de una llave de tres pasos, para el registro de presión de Perfusión Coronaria (PPC).
4.- Preparación del Sistema Langendorff
Para comenzar el experimento se procede de la siguiente forma:
1.- Encendemos en primer lugar el calentador de agua con termostato graduado para mantener una temperatura de 37ºC (figura 6). De este calentador el agua circula continuamente a través de un intercambiador de calor, que va a mantener la solución de perfusión caliente. Esta circulación se realiza gracias a una bomba de agua colocada en el interior del calentador de agua.
Desde que se enciende hasta que alcanza la temperatura deseada pueden transcurrir unos veinte minutos.
2.- Abrimos la bombona de carbógeno (95% O2 y 5% CO2) para oxigenar la solución de perfusión en el reservorio. El flujo de carbógeno lo regulamos mediante el rotámetro o regulador de presión (figura7), el cual se encuentra interpuesto entre la bombona y el reservorio.
3.- Ponemos en marcha la bomba peristáltica de perfusión (figura 3), definiendo el flujo de perfusión que se mantendrá constante a lo largo de toda la experiencia. La solución comienza a circular por todo el sistema, de manera que una vez que éste está relleno se cierra mediante una llave de tres pasos que permite la recirculación de la solución. Se realiza un purgado exhaustivo del sistema para que no quede nada de aire en el circuito. El primer tramo del circuito queda fácilmente purgado gracias a un atrapador de burbujas insertado tras la bomba (figura 4). Además, la cámara de aire que se crea en el atrapador de burbujas amortigua las oscilaciones de presión y el flujo producidas por los rodillos de la bomba, de manera que la presión y flujo de la solución es constante, con lo que las oscilaciones de presión que detectemos serán debidas a cambios en las resistencias coronarias. El purgado del resto del circuito se facilita estableciendo un flujo alto y la inyección de solución a alta presión, mediante una jeringa de 50 mL, a través de una llave de tres pasos insertada justo a la salida del intercambiador de calor. Una vez comprobado que no hay burbujas de aire en el circuito, el sistema está listo para comenzar la perfusión del corazón.
4.- Preparamos el sistema de registro de Presión Isovolumétrica constituido por un balón de látex que se introduce en el Ventrículo Izquierdo, cánula metálica sobre la que va montado, alargadera auxiliar con dos llaves de tres pasos y la jeringa de precisión con micrómetro (figuras 5 y 8). A través de una de las llaves de tres pasos, y por medio de la alargadera auxiliar, se conecta este sistema al transductor de presión. A través de la otra llave de tres pasos se llena la jeringa de precisión con agua bidestilada. Una vez purgado, se hace una prueba aplicando presión constante sobre el balón, de unos 70mmHg durante 10 minutos, no admitiendo un descenso de presión de más de 2mmHg. Si esto ocurriera hay que volver a revisar todo el sistema.
5.- Por último encendemos el sistema de registro de presiones invasivas Power Lab (figura 9). Está compuesto por un amplificador principal al que se conectan otros dos aparatos de registro de presión, uno para la presión del balón y el otro para la de la aorta. A este amplificador principal también se conecta el termómetro y el sistema de marcapasos. Con este sistema podemos registrar la frecuencia cardiaca del corazón, la Presión de Perfusión coronaria (PPC) y las presiones desarrolladas por el Ventrículo Izquierdo (PVS, PVD y PVM), obtenidas a través de los transductores de presión conectados en el sistema a tal efecto. Para que las medidas sean correctas, hay que hacer un ajuste a cero de las presiones mediante la apertura de los transductores de presión al aire.
Una vez preparado el sistema se deja en modo de recirculación y oxigenando la mezcla de perfusión, y pasamos a extraer el corazón.
5.- Montaje del corazón en el sistema Langendorff
Una vez extraído el corazón, se sumerge rápidamente en solución krebs a 4ºC y se transporta hasta el laboratorio donde se encuentra el sistema Langendorff. Tras pesar el corazón en la balanza digital, se le inserta la cánula en la aorta y se fija con seda del nº 5 y se conecta al sistema de perfusión (Figura 11).
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Inmediatamente se inicia la perfusión del órgano con la solución Krebs-Henseleit a 37ºC y burbujeada con carbógeno (95% O2 y 5% CO2). La perfusión del líquido se realiza de modo constante. El ritmo de perfusión (6ml/g de peso del corazón) fue elegido tras varias experiencias previas, realizadas en nuestro laboratorio, para probar distintos ritmos de perfusión en función del peso del órgano, obteniendo como resultado un nivel óptimo de presión de perfusión coronaria (70 a 90mmHg) a 6 ml·min-1/g de peso.
5.1- Preparación del corazón
Tras el inicio de la perfusión, se comienza la preparación del corazón para el inicio de la experiencia:
· Se realiza una incisión en la aurícula izquierda, a través de la cuál se introduce el balón de látex hasta el Ventrículo Izquierdo. Dicho balón está conectado a través de una cánula y una alargadera a una jeringa de precisión, formando un circuito independiente relleno de agua destilada y correctamente purgado antes de cada experiencia, para evitar la formación de burbujas que puedan distorsionar la medida de presión intraventricular transmitida a través de este circuito a un transductor de presión. El balón se fija en ésta posición y tras un periodo de estabilización, se procede al inflado del mismo de forma gradual, mediante la jeringa de precisión, hasta lograr estabilizar la Presión Telediastólica en el Ventrículo Izquierdo (PVD) en 10 mmHg , manteniendo este volumen constante durante toda la experiencia, para realizar la evaluación de la función isovolumétrica del ventrículo izquierdo.
· Para la medida de la Presión de Perfusión Coronaria (PPC), poseemos un sistema de presión situado en la raíz aórtica con una conexión lateral desde la cánula aórtica, mediante una llave de tres pasos y una alargadera rellena de agua destilada, convenientemente purgada.
· Por último, se insertan en las paredes ventriculares los electrodos de detección para electrocardiograma continuo de tres derivaciones y estimulación de marcapasos y el termistor para monitorización de la temperatura.
Tras la finalización de la experiencia, el corazón fue, de nuevo, pesado para determinar el edema producido y finalmente se introdujo en una estufa para desecación, con termostato hidráulico, lector de temperatura con resolución de 2 grados y un rango de temperatura de 0 a 200 ºC.
5.2.- Estabilización y medidas de parámetros basales
Una vez finalizada la preparación de la experiencia, todos los corazones son sometidos a 30 minutos de estabilización durante los cuales se instalan los electrodos, el balón ventricular y el sensor de temperatura en la pared del ventrículo derecho. Se conecta el estimulador de marcapasos para mantener una frecuencia cardiaca entorno a 160 latidos por minuto.
Una vez transcurrido este periodo se procede a la recogida de datos correspondientes a la situación basal (M0). Consisten en:
- Frecuencia cardiaca espontánea
- Presión Ventricular Sistólica (PVS)
- Presión Ventricular Diastólica (PVD)
- Presión Ventricular Media (PVM)
- Presión de Perfusión coronaria (PPC)
- +/- dp/dt
A partir de estos datos, se llevará a cabo una evaluación completa de la función miocárdica antes de las intervenciones que aplicaremos a cada grupo de corazones midiendo los siguientes parámetros.
6.- Evaluación de la mecánica cardiaca:
Esta evaluación se realizó a través de datos hemodinámicos directos obtenidos durante la experiencia y otros parámetros calculados a partir de aquellos como
6.1.- Presión Pico (valor máximo de la Presión Ventricular Sistólica, PVS):
Es el valor máximo de la curva de presión ejercida por el ventrículo izquierdo para un momento dado en el que se toma la medida. Estos valores se registran en cada fase del ensayo (figura 12).
6.2.- Presión Ventricular Media (PVM):
Es el valor medio calculado entre el valor máximo y el mínimo de la curva de presión ejercida por el Ventrículo Izquierdo sobre el balón intraventricular colocado en el mismo (figura 12).
6.3.- Presión Ventricular Diastólica (PVD):
Es el valor mínimo de la curva de presión ejercida por el ventrículo izquierdo para un momento dado en el que se toma la medida. Esta variable la fijamos a un valor de 10 mmHg llenando el balón intraventricular mediante una jeringa de precisión, con un volumen conocido, de manera que los cambios que se produzcan en esta van a ser debidos al funcionamiento del Ventrículo Izquierdo (figura 12).
6.4.- Presión de Perfusión Coronaria (PPC):
Como ya vimos en el capítulo anterior, la PPC, cuando trabajamos a un flujo de perfusión constante, es una función directa de las referencias coronarias, que a su vez dependen del radio de los vasos coronarios. Los resultados se muestran en las tablas desde la 5-3 a la 5-10. Se han obtenido también la Presión arterial sistólica (PAS), la diastólica (PAD) y la media (PPC). También se aplica un estadístico t para observar si hay un aumento significativo de la PPC dentro de cada grupo.
6.5.- Resistencias vasculares (RV):
Este parámetro nos da una idea de la resistencia que ejercen las coronarias a la perfusión de la solución salina. Es un parámetro calculado a partir de la PPC y el flujo de perfusión en cada momento.
Las resistencias coronarias pueden ser calculadas en el sistema Langendorff con la siguiente fórmula:
RV = ∆P / F
Donde las resistencias coronarias se obtienen del cociente entre la Presión de Perfusión (∆P=PPC) y el Flujo Coronario (F). Como en nuestro modelo el flujo es constante, las resistencias coronarias dependen estrechamente de la Presión de Perfusión Coronaria.
Durante el periodo de isquemia todas las variables nos dan un valor de cero, ya que el corazón llega a pararse por completo.
6.6.- Frecuencia Cardiaca espontánea
Se obtiene mediante la inserción de tres electrodos de detección de Electrocardiograma continuo de tres derivaciones conectados al sistema Power Lab y al ordenador. Para la función de marcapasos se utiliza un estimulador externo , manteniendo la frecuencia cardiaca en un valor fijo de unos 160 spm.
6.7.- Presión liberada por el ventrículo izquierdo
Mediante la conexión del balón intraventricular a un transductor de presión y al sistema Power Lab, se obtiene la curva de presión desarrollada por el V.I. con las cifras de presiones sistólicas, diastólicas y la media. Estas cifras nos permiten el cálculo de la Presión Liberada por el V.I. (PLVI) como la diferencia entre la presión Pico (PPVI) y la PVD.
PLVI = PPVI – PTDVI
6.8.- +/- dP/dt:
La valoración de la contractilidad miocárdica de una forma más completa requiere además el análisis de la velocidad de acortamiento de la fibra cardiaca. Para este propósito, se realiza el estudio del incremento de presión con respecto al tiempo de dicha curva, es lo que llamamos el +dp/dt max. Obtenemos de este modo un parámetro representativo de la función sistólica o contractilidad (+dp/dt). Este análisis se realizó mediante la conexión del monitor a un PC y un programa de adquisición de datos para el análisis de la señal analógica procedente del monitor de presión invasiva .
Mediante un programa de adquisición de datos instalado en un PC y conectado al sistema Power Lab de registro de señales, Chart versión 5 en castellano, obtenemos la curva de presión ventricular (figura 13). A partir de esta obtenemos una nueva variable, el + dP/dt máximo, que se calcula como el valor máximo de la derivada de la curva de Presión desarrollada por el Ventrículo Izquierdo, un buen indicador de la contractilidad miocárdica.
Del mismo modo se puede valorar la función diastólica mediante el análisis estadístico de los valores del – dP/dt máximo, es decir, el máximo valor (en valor absoluto) de la derivada de la curva de Presión, en su vertiente negativa o descendente, correspondiente a la diástole ventricular.
Eva Calderon ,Antonio Ordoñez
Laboratorio Investigación Cardiovascular
Sevilla